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核酸检测技术的应用

 

对血液进行病毒核酸检测(nucleic acid technology,NAT)


HIV感染以后,HIV RNA比P24抗原出现大约早5 d,在感染以后11 d就可以检测出来,因此理论上检测病毒的RNA可以大幅度缩短窗口期,降低残余危险度,提高输血的安全性。但是核酸检测的高成本以及操作的复杂性又限制了这种方法的广泛应用。因此,必须探索一种低成本、操作简便的HIV RNA检测方法并在采供血系统中推广。为了降低成本,一般是将一定数量的待检标本混合,制备混合样品,对混合样品进行病毒核酸检测,发现阳性以后再分别检测确定阳性标本。


1994年美国FDA曾经开会探讨NAT方法检测献血员的可行性,那时认为虽然这个方法非常敏感,但是并不适合大范围应用,但是发展核酸检测技术应该很有前途,因为这个方法可以发现早期感染并减少窗口期献血。在这以后,试剂生产厂家和血液组织与政府合作,发展了检测HIV/HCV的NAT方法,检测混合样品的核酸更加合理有效。1997年开始对NAT方法进行临床评估,因为窗口期献血的很少,所以评估的范围很大。1997年,欧盟的一些生产单位开始自发地检测混合样本的NAT,1999年7月欧盟要求所有的原料血浆必须进行HCV RNA的检测,并要求随后进行HIVRAN检测,2001年9月,FDA批准了几个用于全血、原料血浆和成分血中检测HIV/HCV RNA的试剂,并支持NAT方法取代P24抗原检测。对于HIV/HCV,推荐首先进行抗体检测,阴性或没有反应可进一步做HIV/HCV的NAT检测。进行NAT检测以后,就没有必要再做HIV-1 P24抗原的检测了。


美国1999年开始对献血员进行HIV/HCV的NAT检测,在3年时间内,在37 164 054.单位血液中确认了12份HIV RNA阳性,其中只有2份HIV-1 P24抗原也是阳性。对于HCV,检测了39721 404份,确认了170份HCV RNA阳性,随访证实了67人发生了HCV的血清学阳转。结论是NAT能够每年预防5例HIV、56例HCV感染,减少残余危险度至200万分之一。


目前,欧洲多数国家、美国、加拿大、澳大利亚等国都已经对血液进行了NAT检测。制备混合样品的标本数不尽相同,有的将16-32份标本混合制备1份混合样品,也有的将96份标本混合制备1个混合样品。欧洲1997年1月开始对献血员进行NAT检测,至今共检测了360万份血液,将96份标本混合制备1个混合样,为了补偿标本混合稀释导致的敏感性下降,将标本用48 000 g进行离心以提高敏感性,结果确认了6例HCV RNA阳性、2例:HIVRNA阳性而抗体阴性的献血员,发现了39名和11名多次献血的人发生HCV和HIV血清学阳转,并由此启动了对血液的LOOKBACK程序。也有同时定量、定性检测血浆中HBV、HCV、HIV核酸的方法,一种病毒基因的扩增不受同时存在的另外两种病毒基因的影响,HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的95%检测限分别是30、167和680 IU/ml,可以对HBVA-F型、HCV1-6型和HIV-1A-G型同样有效地扩增。NAT方法的应用进一步降低了残余危险度,如法国没有使用NAT方法时(1992年),HIV和HCV的残余危险度分别是1/1 400 000和1/1 000 000,使用NAT以后(2002年),HIV和HCV的残余危险度分别降低了1/2和6/7,达到1/2.5百万和1/6.65百万。HIV、HCV、HBV三者总的残余危险度从1992年的1/65 000下降到2002年的1/235 000,降低了28%。


NAT检测方法的高成本是一个巨大的负担,成本效益分析显示,美国采用NAT检测方法以后,每年可以避免37例HBV、128例HCV和8例HIV献血,挽救大约53个质量调整生命年。全血HIV、HCV NAT的花费是大约每年1.55亿美元(混合标本NAT)和4.28亿美元(单份标本NAT),如果加上HBV DNA的NAT检测,每年需另外支出0.29-1.30亿美元。总的来说,采用NAT方法,平均挽救一个质量调整生命年的支出是470-1 120万美元,停止P24抗原和抗HBC检测可能会有些补偿。因此全血NAT检测的成本效益很低,代价很大,需进一步降低成本才能推广应用。


尽管采用NAT方法使检出早期HIV感染的能力大大提高,但是受敏感性的限制不能发现所有早期感染的人。美国FDA要求NAT检测HIV RNA的敏感性要达到100 cp/ml,但是标本混合以后被稀释,低病毒载量的标本有可能检测不出来,已经证实5~39 cp/ml HIV RNA就可以传播HIV。美国疾病预防控制中心2003年报道了2例窗口期传播HIV的病例,献血员HIV抗体、P24抗原和HIV RNA NAT检测均为阴性,但是造成了2名受血者的感染。意大利2003年报道,1名献血员HIV-1 RNA NXT检测为阴性,献血10 d以后HIV-1 RNA转为阳性,但是P24抗原仍然为阴性,献血41 d以后抗体转为阳性,他的血液造成了1名受血者的感染。因此采用NAT方法以后仍然可能传播HIV,要进一步降低输血的风险,需要对血液进行单份核酸检测,但是检测的高成本又常常难以承受,发展简便、低成本的HIV NAT检测方法已经成为当务之急。


残余危险度指血液经过筛选以后仍然存在的传播疾病的危险,主要来自3个方面:①窗口期供血及不典型血清转换。②病毒变异。③实验室检测的误差。检测方法的进步使得检出早期HIV感染的能力不断提高,窗口期供血的危险不断下降,但是随着对血液检测项目的增加和检测方法难度的提高,血液筛选的程序和方法变得愈加复杂,检测的错误和误差成为导致残余危险度的主要原因,加强质量保证和质量控制程序成为另一项重要的任务。

核酸检测技术(NAT)应用于我国血液制品的筛查


中国生物制品规程规定, 血液制品是指“由健康人血浆或特异免疫人血浆分离、提纯或由重组DNA 技术所制的血浆蛋白组分或血细胞组分, 如人血白蛋白, 主要用于诊断、治疗或免疫预防”。 但是通过血液制品传播的病毒有很多种,其中H IV、H BV、HCV 等几种病毒由于感染率高, 危害严重,受到国内外医学界的关注。
广泛用于血液筛查的方法主要是ELISA, 即酶联免疫吸附法, 是指采用抗原与抗体的特异性反应将待测物与酶连接, 然后通过酶与底物发生颜色反应, 用于定量测定, 测定的对象可以是抗体或者抗原。 用此方法对血浆进行病毒筛查已经显著降低了原料血浆的病毒污染, 但仍存在病毒传播的危险性, 如: 病毒感染者“窗口期”献血, 病毒发生变异, 免疫静默感染及人工操作失误等 。 


为缩短病毒抗体检测的“窗口期”, 目前NAT检测方法成为国内外研究热点, NAT是一系列直接检测病原体核酸的技术的总称, 主要是使用一些物理、化学和生物学的方法, 通过靶核酸扩增的方法, 将极微量的核酸转变成直观的光电或可视信号, 从而判断是否存在病原体 。 此方法敏感度高, 可检测出极微量的核酸, 大大缩短了“窗口期”, 并已在欧美等国家血液制品行业和我国少数血液制品生产企业得到应用, 有必要在我国血液制品生产企业进一步加以推广。

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