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核酸检测
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●检测方法


核酸检测方法,主要通过同时进行靶核酸扩增和可检测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核酸检测。  

目前主要使用的方法有以下几种:


一、核酸序列依赖性扩增法


NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在 42 ℃进行 ,可在 2 h内将RNA模板扩增约 109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA 退火, 在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA,RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA,进入循环相,对模板进行大量扩增。


二、转录介导的扩增技术


TMA技术原理与NASBA基本一致,略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶,MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在 41.5 ℃进行 ,可在 1 h内将RNA模板扩增约109倍。


三、连接酶酶促链式反应(LCR)


LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术,是继PCR后新发展的一种较有前景的体外扩增技术。它的原理就是由2段寡核苷酸单链DNA探针与目标序列杂交,当该2段DNA探针与没有发生突变的模板褪火后,如果2探针是紧邻的,中间没有核苷酸间隔,则可在连接酶作用下连接起 来,连接以后的新链又可以作为模板,引导下一周期的连接产生新的子链。若连接区段发生核苷酸的碱基突变,则连接反应不能发生,扩增反应终止。


四、多聚酶链反应检测法(PCR)


PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。


① 模板DNA的变性:模板DNA经加热至93 ℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。


② 模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55 ℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。


③ 引物的延伸:DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成1条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性—退火—延伸三过程,就可获得更多的 “半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成1个循环需2~4 min, 2~3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。检测HIVRNA,需要先利用逆转录反应将RNA转录为cDNA,继而以cDNA为模板进行PCR扩增即可,这样的反应称为RT-PCR。


五、实时荧光定量PCR技术


实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
本技术的原理是使用荧光基团标记探针,5′端标记荧光基团R,3′端标记淬灭基团Q,在没有PCR扩增时,由于荧光基团和淬灭基团空间距离很近,使荧光基团被淬灭,不发荧光;而当PCR扩增时,引物与荧光标记的特异性探针同时结合在模板上,荧光标记的探针与模板的结合位置位于上下游引物之间, 利用Taq酶的5′3′外切酶活性,将荧光探针水解,荧光基团被释放出来,由于在空间上与淬灭基团分开,则发出荧光。发出的荧光可以被荧光探头检测到, 一边扩增,一边检测,这样就实现了“实时”检测。该技术不仅实现了PCR从半定量到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性强、自动化程度高、有效解决了PCR污染问题等特点。


六、支链DNA检测法——bDNA


bDNA是定量检测血浆中的HIV1型RNA的一种方法。bDNA是指人工合成的带有侧链的DNA片段,在其每个侧链上都可以标记被激发的标记物。将HIV的RNA通过离心从病毒颗粒中释放出来,然后用捕获探针1将其捕获到微孔中。捕获探针2与病毒RNA的另一部分特异结合,又与预放大探针结合。后者再与放大探针即bDNA探针杂交。两套靶探针分别与病毒RNA的pol基因的不同区域特异结合。在微孔中形成HIVRNA寡核苷酸复合物。再加入1种化学发光底物孵育后可放大化学发光信号。通过发光强度来定量,因为发光强度与样品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在扩增物的交叉污染,这 较PCR是一大进步。bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针,可以方便地检测HIV某些变异株,但灵敏度不及PCR,提高bDNA灵敏度是一大难点。

 

 

 

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